老年性痴呆（Alzheimerpsdisease, AD)是一种神经退行性疾病，多发生于老年人，发病隐匿，病程长，发病机制不清楚，其主要的病理特征为老年斑形成和神经纤维缠结。β淀粉样蛋白（β-amyloid,Aβ）沉积是老年斑形成的主要原因，被认为是AD发病的关键。

1991年，美国圣路易斯大学医学院老年研究教育与临床中心的JamesF. Floood等人首次研究证明侧脑室注射外源性Aβ（片段1-28）能够剂量依赖性损伤小鼠在电机主动回避训练中的记忆能力。随后，美国明尼苏达大学精神科的MichaelP. McDonald等人于1994年发表研究证明Aβ1-40损伤SD大鼠的记忆巩固阶段。

Aβ注射模型成为AD转基因模型的重要补充，在研发AD新的治疗手段中起重要作用。动物侧脑室或海马注射凝聚态Aβ1-40可以很好的模拟老年斑引起的记忆损害和老年斑周围的小胶质细胞活化、炎症相关因子表达。Aβ侧脑室或海马注射动物模型是AD研究中经典的动物模型之一。亦有研究把Aβ脑室注射模型与其他模型结合起来构建复合模型，用于活性成分的筛选，如结合皮下注射氢化可的松建造肾虚型老年痴呆动物模型和结合自然衰老建造拟AD复合模型。

脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是大多数革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分,它存在于细菌细胞壁的外层，常被作为炎性刺激物来引起机体的免疫活性状态。LPS的致炎途径如下，LPS先与LPS 结合蛋白结合，把血浆中的LPS 传递给单核巨噬细胞和中性粒细胞上的锚定膜结合蛋白CD14，激活中枢神经系统小胶质细胞TLR4 受体，诱发明显的中枢神经系统炎症反应，表现为脑内小胶质细胞激活并产生大量的炎性细胞因子，如IL-1β、IL-6和TNF-α等。这些炎症因子可影响海马长时程增强效应、突触可塑性等，从而损害记忆的形成与维持。脑部注射LPS可导致动物的学习记忆障碍，为研究慢性神经炎症相关的认知功能障碍提供了一个很好的模型。

大鼠（体重260-300 g），主要品种有SD和Wistar大鼠；小鼠（体重25-30 g），主要品种有C57BL/6、ICR和Swiss albino小鼠。多用雄性，亦有雌雄各半。

1. 药品与试剂

Amyloid β 蛋白片段1-40（也有采用Aβ1-28、Aβ1-42或者Aβ25-35）；水合氯醛（或其它麻醉药物如戊巴比妥钠）；无菌生理盐水（或PBS或双蒸水）；H2O2溶液；青霉素钠粉。

脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)，临用前配制成不同浓度备用，通常使用无菌生理盐水或人工脑脊液稀释，根据实验要求进行选择；麻醉药物水合氯醛或戊巴比妥钠；30% H2O2溶液；青霉素钠粉末或注射液。

2. 实验仪器

脑立体定位仪、微量注射泵、微量注射器、手术剪、手术镊子、缝合针线等。

3. 实验方法

3.1. 药品制备

Aβ1-40溶液：临用前将Aβ1-40溶于无菌生理盐水（或PBS或双蒸水）中配制成1 μg/μL母液，置于37 ℃孵育7天，使其聚集、老化，分装后，-20 ℃保存备用；

10%(m/v)水合氯醛溶液：称取水合氯醛10g，加入生理盐水定容至100 mL，备用。

3.2. 手术（以大鼠为例，小鼠操作参照此进行）

（1）定位参照George Paxinos的脑立体定位图谱及预实验结果，基本步骤如下：

（2）动物称重，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉；

（3）将大鼠头顶局部用动物去毛器去毛，消毒，并固定于脑立体定位仪上；

（4）大鼠头顶处正中矢状切口，使用眼科剪剪开切口长约2 cm，用棉棒沾少许H2O2清除骨膜，并用手术刀片将残物刮除干净暴露十字缝，确定前后囟，并使之处于同一平面；

（5）坐标定位

大鼠：

海马：取前囟后AP：-3.3 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±2.0 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：3.0 mm （如图1A）；

侧脑室：取前囟后AP：-0.9 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±1.5 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：3.8 mm（如图1B）；

小鼠：

海马：取前囟后AP：-2.46 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±2.2 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：2.1 mm （如图2A）；

侧脑室：取前囟后AP：-0.3 mm，正中矢状缝左右旁开ML：±1.0 mm处使用牙科钻钻孔，进针深度为DV：2.5 mm（如图2B）；

（以上坐标为较常见值，亦有许多其他坐标，实验坐标值以自己预实验结果为主。）

（6）将微量注射器固定于注射泵臂上，缓慢插入钻孔，单侧海马注射Aβ1-40溶液5 μL，注射速度为1 μL/min，留针5min后缓慢撤针；

（7）注射完毕后将青霉素钠盐少许撒于创口处缝合皮肤。

（8）动物手术后观察5-7天，剔除状态不好的动物。

4. 行为实验

动物手术后观察5-7天，剔除状态不好的动物。利用行为学设备开展学习记忆行为实验检测。

5. 注意事项

（1）模型建立应严格按照定位图谱进行，撤针时要求缓慢（5min），以防注射的注射药物通过针道溢出；

（2） 采用冰冻切片，有利于快速病理染色以证实是否到达注射点；

（3）取材时应取前囟后2～5 mm脑组织冠状切片，以防止取材过多或错过注射点。

6. 模型分析指标

6.1 水迷宫

圆形迷宫直径为159 cm、高50 cm，池中水深25. 5 cm 左右，内置平台直径9 cm、高24 cm，水温维持在( 24 ± 1) ℃。将迷宫置于空间信息相对丰富的实验环境中，作为动物学习过程中的空间参照物，整个试验周期内保持环境信息固定不变。将迷宫均分为4 个象限，将平台置于其中一个象限中央，作为实验中动物逃离水环境的唯一途径，空间记忆阶段保持平台位置固定不变。选择其余3 个象限作为动物的入水点将动物面向池壁放入水中，每天训练3 次，每次变换入水点位置( 使动物可分别从3 个象限入水) ，且每天所有动物入水点的顺序保持一致。每次训练前适应10 s，使动物获取并学习空间环境信息。设置检测时间为90s 后，将动物放入水中，若动物在90 s 内找到平台，算作寻台成功并记录其潜伏期，并使其在平台上停留休息10 s。若动物在90 s内未找到平台，结束此次训练并记录潜伏期为90 s，并引导动物靠近平台使其在平台上停留10 s。每只动物训练的时间间隔为40 min。每天每只动物3 次训练学习的潜伏期平均值，作为评价动物这一天学习能力的指标。经过5d 的训练学习后，第6 天撤去平台，进行空间探索实验。将动物从原平台象限的对角象限面向池壁放入水中，检测其在90s内穿过原平台所在位置的次数，作为评价空间记忆能力的指标。

6.2 被动回避实验

 实验包括获得、巩固两个部分

（1）避暗获得实验：睡眠干扰第27天进行避暗获得实验。实验前每只小鼠面向拱门由明室放入，适应3 min。然后开始学习，将小鼠由明室背向拱门放入，当其进入暗室时，给予0.5 mA（5 s）的电击，共学习5 min。

（2）巩固实验：获得实验24 h后进行避暗巩固实验，仍将老鼠按原方式由明室放入，记录5 min内的错误次数、进入暗室的潜伏期、在暗室停留时间等指标。实验后将老鼠取出，放回笼中。

1. 脑室注射Aβ对水迷宫的影响

正常组与假手术组动物的寻台潜伏无显著性差异（P > 0.05），且接近；与正常组相比，模型组day1-day5寻台潜伏期显著性增加（P < 0.05），穿台次数显著性减少（P < 0.05）。

图4 脑室注射Aβ对水迷宫寻台潜伏期的影响

图5 脑室注射Aβ对水迷宫穿台次数的影响

2. 被动回避实验

暗室潜伏期，正常组和假手术组无显著性区别（P > 0.05），与假手术组相比，模型组暗室潜伏期显著性下降（P < 0.05），错误次数模型组比假手术组有所增加，但无显著性差异（P > 0.05）。

本实验采用健康成年SPF级老鼠。饲料垫料均为高压灭菌产品，购自北京维通利华实验动物有限公司，动物用水均经过除菌处理。实验动物以完整的包装直接进入实验室，观察适应5天后无异常情况，方进行实验。实验过程中动物操作均符合动物伦理学规范，对环境和生态影响等符合国家相关法律规定。

给予动物鼠笼倾斜、潮湿垫料、高温、噪音、束缚、电击、游泳、昼夜节律颠倒等不同刺激因子，且刺激因子安排为多变性和不可预测，可诱导性是模型制造成功的关键。该模型被广泛用于抑郁症神经生物学机制及抗抑郁药物的研究，以及伴发的焦虑、学习记忆障碍及防护药物研究。

本研究中，通过水迷宫实验、避暗实验结果可以看CUMS模型组水迷宫寻台潜伏期显著性延长，避暗错误次数显著性增加、避暗潜伏期显著性减少等，这些行为学结果，提示大小鼠CUMS模型成功。此外本实验还对CUMS模型的机制进行了基础研究，认为CUMS模型会导致动物皮层的5-HT、DA、Ach、NE等神经递质水平显著性降低（P<0.05）。因此我们认为采用慢性不可预测应激，35天可以造成大鼠和小鼠学习记忆障碍。

模型技术难点在于对于CUMS刺激因子的选择，刺激因子的选择可能影响实验模型的成功与否，常用的刺激因子有禁食(12 h)、禁水(12 h)、冷水游泳(4 °C，5 min)、热水游泳(42 °C，5 min)、动物叫声(0.5 h)、束缚(使用自行研发的小鼠行为限制器，长20 cm，直径7 cm)、昼夜颠倒、配对饲养、湿笼、倾笼等。每日选择2~3 种刺激，并尽量使应激程序符合不可预测的特点，以避免动物产生适应性。相同的刺激因子应该隔3-7日再进行。

本研究通过不同的刺激因子对老鼠造成慢性不可预测应激模型，通过水迷宫、避暗等经典行为学指标，以及5-HT、DA、Ach、NE等神经递质基础机制指标，表明了慢性不可预测应激诱导老鼠学习记忆损伤模型的成功，并且该模型对于大小鼠具有相同的效果，本模型可用于进一步的改善学习记忆药物的药效学评价。